產(chǎn)品特點
本試劑盒是基于 T7 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，它利用含有T7 啟動子的模版 DNA，以 NTP 為底物，從 T7 啟動子下游開始合成與模版DNA 中一條鏈互補的RNA，簡單快速獲得大量的 RNA 分子。
它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需提供含 T7 啟動子的 DNA 模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實驗不需要單獨準(zhǔn)備每一個成份。
2. 單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。
3. 模版 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴增產(chǎn)物。
4. 可以合成的 RNA 的佳長度在 20nt 到 2000nt 之間。
5. 產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化，每 1μg DNA 模版可以合成2～6μg RNA。
6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結(jié)構(gòu)研究、核酶生物化學(xué)、體外翻譯、RNA蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實驗。
7. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的體外轉(zhuǎn)錄實驗并且只能用于科研。。
成分規(guī)格
產(chǎn)品組成
T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液 2× 0.5 mL
RNase-free 水 水 1mL
保存條件
-20℃可保存 12 個月
自備試劑
Tris 飽和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇。
制備 DNA 模板
（本試劑盒不含所需試劑，此處信息僅供參考）PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點。
a)必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切成線狀。
b) 需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的上游必須有 T7 啟動子。如果模板是PCR產(chǎn)物，則可以在設(shè)計引物時將 T7 啟動子序列 5′TAA TAC GAC TC A CTA TAGGG3′加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T7 啟動子的載體，并且克隆位點必須位于 T7 啟動子下游。
c) 需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端不要是 3′突出。如果是3′突出（比如選擇了 Pst I 來線性化質(zhì)粒），則用 T4 DNA 聚合酶修平。
d) 必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質(zhì)粒 DNA 的過程中一般要使用大量的 RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，采取膠回收的方法純化質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總RNA 一起保溫然后電泳檢測 RNA 是否被降解，以此來判斷純化的 DNA 模板是否有殘留RNase A。如果有 RNase 污染，則必須反復(fù)酚氯仿抽提去除殘留的RNase 然后再乙醇沉淀質(zhì)粒DNA。
體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
1. 如果有 N 個樣品，強烈建議做一個陰性對照，故共設(shè)置N+1 個反應(yīng)，這樣一起并排電泳時容易判斷哪個條帶是模板 DNA，哪個條帶是轉(zhuǎn)錄擴增得到的RNA。在N+1 個 RNase-free 的塑料離心管中，在室溫下（不是在4℃下）按次序加入下列成分，T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液容易產(chǎn)生結(jié)晶，沉淀一定要握在手中直到結(jié)晶徹底溶解并搖勻后方可使用。
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成分
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N 個樣品管
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陰性對照管
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DNA 模板
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100-500ng左右的PCR片段或線狀質(zhì)粒
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－
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2×T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液
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各10μL
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10μL
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RNase-free 水
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至20μL
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至20μL
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注：此為 20μL 反應(yīng)體系的用量，對其他反應(yīng)體系，各成分的用量可以按比例增減。本產(chǎn)品的2×T7轉(zhuǎn)錄預(yù)配液已經(jīng)含有 NTP。如果需要標(biāo)記 RNA 探針或制備帶帽 RNA，則需要訂購NTP 分開的試劑盒。
2.37℃保溫 1-2 小時(注意：延長保溫時間并不能大幅提高產(chǎn)量。
3. 加入 2μL 自備的 500mM 的 EDTA 溶液滅活 T7 RNA 聚合酶。
4. 取 5μL 電泳，此時加上一個 DNA 模板做電泳對照。電泳時比陰性對照多出的條帶就是轉(zhuǎn)錄擴增得到的 RNA，由于合成的 RNA 長度不均勻，即使長度均勻，但由于自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，泳動速度也不一致，所以電泳所得RNA條帶一般都不是清晰單一條帶，而是比較彌散的電泳條帶。但由于RNA 是單鏈，分子量比同樣長度的 DNA 小一倍，因此 RNA 一般比其雙鏈 DNA 模板電泳速度更快。
5. 定量，可以用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒檢測濃度。不推薦使用電泳定量。使用本試劑盒時 1μg 的 DNA 模板一般可以合成 2～6μg 的RNA。
6. 得到的 RNA 可以放 80℃保存。如需去除 DNA 模板，請按下面步驟操作。
去除 DNA 模板（所需試劑需要另購）
1. 在 20μL 體積的體外轉(zhuǎn)錄體系中加入 2μL 的 10×DNase Buffer 和1μL自備的RNase-free DNase 3～5U/μL。
2. 37℃保溫 30 分鐘。
3. 補 RNase-free 水到 100μL。增加體積可以減少樣品的丟失。
4. 用自備的等體積 100μL 的 Tris 飽和酚和氯仿震蕩混勻后14000g 離心3 分鐘將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。此步去除 DNase 和 RNA 聚合酶。
5. 加自備的 200μL 無水乙醇和 10μL 3M 的乙酸鈉溶液（pH5.2），振蕩后14000rpm離心 20 分鐘，RNA 形成沉淀，棄上清。
6. 在沉淀中加入 1mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 14000g 離心5 分鐘，棄上清。
7. 短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。不要丟失沉淀。
8. 晾干，所得沉淀即體外轉(zhuǎn)錄所得的 RNA。去除 DNA 模板也可以用 PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒。
問題解答
1. 沒有RNA產(chǎn)物。常見原因是模板有RNase污染，可用純化好的RNA跟模板DNA一起保溫再電泳，再檢測其是否有污染。
2. RNA產(chǎn)量低。常見的原因是DNA模板。在轉(zhuǎn)錄序列的一個和二個堿基都是G，在前14個堿基內(nèi)避免有U存在。
3. RNA長度比預(yù)期的短。可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的終止序列。
4. RNA長度比預(yù)計的長。T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一樣，有不依賴于模板的加尾功能，有一半的RNA可以帶一個或兩個堿基的尾巴。如果RNA長度比預(yù)計的長很多，使用的模板又是質(zhì)粒DNA，則可能是質(zhì)粒線性化不徹底。
5. 5′單磷酸還是三磷酸?如果使用GTP，則得到的RNA是三磷酸，體外轉(zhuǎn)錄時如果保溫時間太長（如12小時），則有50%的三磷酸會變成單磷酸。如果在轉(zhuǎn)錄體系中加入GMP，則T7 RNA聚合酶將優(yōu)先使用GMP，所得RNA產(chǎn)物中5'端是單磷酸的比例將大大增加。6. 用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒如何得到帶帽RNA?需加入帶帽NTP類似物即可。
